ЦМБТ

Конференция 20 января

20 января 2005 года в Московском государственном медико-стоматологическом университете состоялась межинститутская конференция "Проблема стволовой клетки в современной биологии и медицине". Конференция прошла при полном зале, до самого конца были заняты не только все сидячие места, но и еще человек 30 стояло. Примерно половину присутствовавших составляли студенты. Было всего четыре доклада, краткое содержание которых опубликовано (ссылка). К сожалению, в каждом из докладов была значительная часть, посвященная "ликбезу" - более или менее упорядоченное перечисление общеизвестных вещей, в трех из четырех докладов демонстрировалась одни и те же картинки из "Stem cells basics" NIH. Кроме того, прозвучали стандартные предостережения от чрезмерных восторгов в отношении клеточной терапии и призывы с осторожностью относиться к сообщениям о трансдифференцировке стволовых клеток и внимательно смотреть, насколько достоверны доказательства.

Гораздо более интересными были сообщения о собственных достижениях лабораторий докладчиков.

А.В.Васильев из ИБРа рассказывал о трехмерных тканевых конструкциях, состоящих из биоматрикса (коллагенового геля или коллагеновых микросфер), заселенного фибробластами, о многослойных пластах кератиноцитов, о "живом эквиваленте кожи" - конструкции, состоящей из двух слоев - стромального элемента (коллагеновый гель с фибробластами) и эпителиального элемента (слой кератиноцитов). При помощи этих тканевых конструкций с большим успехом проводили лечение глубоких незаживающих ран (в т.ч. ожоговых), дефектов роговицы, урогенитальных свищей и т.д. Применялись как аутологичные, так и аллогенные кератиноциты и фибробласты, было показано, что аллогенные клетки сохраняются живыми не менее 30 суток после трансплантации. Докладчик настойчиво старался донести до аудитории две мысли: 1. "эффективность аллогенных трансплантатов определяется индукцией регенерации собственных тканей", а не замещением поврежденных клеток реципиента донорскими. Причем это распространяется не только на фибробласты и кератиноциты, но и на все виды стволовых клеток, которые сейчас пытаются использовать в клинике, в том числе и на аутологичные СК. О доказательствах этого тезиса докладчик умолчал, так что осталось неясным, то ли были сделаны какие-то работы по этой теме в его лаборатории, то ли у него просто сложилось такое впечатление по литературным данным. 2. За исключением гемопоэтических СК, все трансплантируемые клетки являются субстрат-зависимыми, и должны пересаживаться на каких-либо носителях, а в суспензии они сохраняют жизнеспособность не более 30 минут. Это высказывание является весьма спорным, поскольку клетка в "подвешенном" состоянии хотя и не может выполнять своих функций, но и не погибает. При попадании в организм она начинает контактировать с микроокружением и прикрепляется к субстрату за 20-30 минут, становясь при этом функционально активной.

Наиболее интересным в докладе А.Е.Коган было сообщение о стимулирующем эффекте "незавершенного" апоптоза в опухолях на пролиферацию опухолевых клеток. О роли СК в онкогенезе были только общие слова, вроде: "рак должен рассматриваться как генетическое заболевание различных видов стволовых клеток".

А.И.Воложин подробно рассказал о различных материалах, применяемых для замещения костных дефектов и о технологиях заселения их остеогенными клетками (мезенхимальными СК костного мозга) и фибробластами. Проводилось сравнение различных материалов в аспекте эффективности прикрепления клеток к их поверхности, скорости пролиферации клеток и возможностей интеграции имплантов в кость.

Основная мысль в докладе О.В.Зайратьянца - что, стволовая клетка, являясь недифференцированной, не имеет практически никаких специфических маркеров, в отличие от зрелых дифференцированных клеток, и это приводит к сложностям в их идентификации. Несмотря на множество маркеров, выявленных для СК, все они неспецифичны и экспрессируются и другими видами клеток, поэтому для точной идентификации СК одних только маркеров недостаточно. Для выяснения судьбы трансплантированных клеток необходимо метить клетки донора такими, маркерами, которых нет у реципиента. Наиболее достоверные результаты позволяет получать "метод Y-хромосомы", все другие метки могут передаваться собственным клеткам реципиента после гибели трансплантированных клеток.

Рассказывая о случаях применения клеточной терапии в клинике (работы ин-та им.Склифосовского, Кардиоцентра, НИИТиО), докладчики подчеркивали, что очень часто, даже когда есть доказанный клинический эффект, механизмы действия остаются неясными и требуют дальнейшего изучения.

А.В. Васильев, Н.А. Попкова, О.С. Роговая, И.В. Киселев, В.В. Терских
СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ, ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ И КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Клеточные исследования являются одним из наиболее актуальных и активно развивающихся областей биомедицины. Именно с ними связывают сегодня надежды на решении многих социальных и медицинских проблем. Активность подогревается успехами в исследовании эмбриональных и постнатальных стволовых клеток.

Наиболее впечатляющие результаты получены в разработке и реализации клеточных технологий для восстановления целостности тканей. Начало этим работам было положено еще в 80-х годах пионерскими разработками Рейнвальда и Грина предложившими использование клеток для лечения обширных и глубоких ожогов. С тех пор предложен значительный спектр методов лечения различных эпителио-мезенхимных дефектов: ожогов, ран, дефектов роговицы, гортани, урогенитальных свищей, язв эпителия и т.д. Накопленный значительный опыт позволил сформировать новую область биомедицины, называемую тканевой инженерией. Принципы тканевой инженерии позволяют эффективно решать большой круг медицинских задач. Тканевая инженерия это, прежде всего, создание invitro гистотипических трехмерных тканевых конструкций. Такие конструкции, сочетающие в себе биоматрикс с культивированными клетками, или клеточными композициями, могут являться как эффективным трансплантатом, так и моделью ткани или органа in vitro. Важность этого принципа особенно возрастает, когда речь идет об использовании субстрат-зависимых клеток.

Применение аллогенных тканевых конструкций расширяет возможности тканевой инженерии. При этом, эффективность аллогенных трансплантатов определяется индукцией регенерации собственных тканей. Биологические механизмы индукции занимают особое место в регенерации и развитии. Значительна их роль и в обеспечении эффективности клеточных и тканевых трансплантатов.

Важным является наличие в трансплантатах культивированных вне организма клеток, обогащение тканевых конструкций стволовыми клетками. Наличие стволовых клеток обеспечивает эффективное приживление трансплантата и функциональную активность конструкции. Однако, стволовые клетки как таковые, представляют интерес как исследовательский биологический объект. В случае клинического использования, они должны быть встроены в новую медицинскую технологию, предполагающую, прежде всего, разработку адекватной технологии трансплантации. Сегодня, можно точно определять показания к применению различных типов стволовых клеток, например эмбриональных, мезенхимальных, эпителиальных или нейральных, применять их для различных клинических задач. Специфичное и точное использование огромных возможностей, открываемых стволовыми клетками, клеточными технологиями позволяет уже сегодня добиваться 70% эффективности в лечении тяжелых поражений структур и функций жизненно важных органов и тканей.

Е.А. Коган
РОЛЬ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В ОНКОГЕНЕЗЕ
Кафедра патологической анатомии (заведующий-академик РАН и РАМН, проф. М.А. Пальцев). ММА им. И.М. Сеченова

Благодаря успехам молекулярной биологии и генетики получены новые данные о молекулярно-генетических перестройках в опухолях. Однако по-прежнему вопросы этиологии, патогенеза и клеток-источников возникновения опухолей остаются не решенными. Как и раньше здесь больше вопросов, чем ответов.

Несмотря на длительную историю изучения проблемы опухолевого роста, до сих пор не достигнуто единого понимания, что же такое злокачественная опухоль.

R.A.Willis (1967) определял злокачественную опухоль как "патологическую массу ткани с чрезмерным, некоординированным ростом, который сохраняется даже после прекращения действия факторов,его вызывающих".

J.A.Ewing (1940) и H.C.Pilot (1986) в дефиниции злокачественной опухоли подчеркивали, что ее основным отличительным свойством является "наследственно обусловленный автономный рост".

А.И.Струков и В.В.Серов (1995) дают определение злокачественной опухоли как "патологический процесс, характеризующийся безудержным размножением (ростом) клеток... Автономный, или бесконтрольный, рост-первое основное свойство опухоли". Процесс развития опухолей под влиянием канцерогенных факторов носит название канцерогенеза.

В настоящее время рак должен рассматриваться как генетическое заболевание различных видов стволовых клеток. Генетические перестройки могут происходить под действием канцерогенных агентов различных классов стволовых клеток. При этом четыре класса генов являются мишенями канцерогенных агентов:

протоонкогены, регуляторы пролиферации и дифференцировки клеток;
гены супрессоры опухолей (антионкогенов), ингибирующие пролиферацию клеток;
гены, участвующие в гибели клеток путем апоптоза;
гены, отвечающие за процессы репарации ДНК.

Наименее изучены вопросы перестроек названных выше генов в стволовых клетках, а так- же патология апоптоза в канцерогенезе.

Стволовые клетки-самоподдерживающийся пул полипотентных клеток предшественниц различных тканей, носителей генетической информации, сохраняющие способность пролиферировать под действием митогенетических стимулов (контролируемая пролиферация) с последующим созреванием (контролируемая дифференцировка).

Описаны различные разновидности стволовых клеток: эмбриональные стволовые клетки,

костномозговые стволовые клетки (гемопоэтическая и стромальная), а также тканевые стволовые клетки. Доказана возможность трансдифференцировки стволовых клеток. При этом они могут стать источником развития тканей совершенно иного гистогенеза.

Значение костномозговой стволовой клетки-поддержание пула тканевых стволовых клеток различных органов, участие в репаративных процессах в различных органах. Повреждение генома костномозговой стволовой клетки может приводить к развитию не только лейкозов и лимфом, но и злокачественных опухолей других органов, в том числе и первично-множественных.

Апоптоз-это генетически запрограммированная смерть клеток в живом организме. При опухолевом росте апоптоз имеет некоторые особенности, наиболее полно изученные нами при раке легкого. Основная биологическая роль апоптоза в норме-это установление нужного равновесия между процессами пролиферации и гибели клеток, что в одних ситуациях обеспечивает стабильное состояние организма, в других-рост, в третьих-атрофию тканей и органов. В норме апоптоз имеет место в ходе эмбриогенеза на стадиях преимплантации, имплантации плодного яйца и органогенеза. Исчезновение клеток путем апоптоза хорошо документировано при инволюции мюллерова и вольфова протоков, межпальцевых перепонок, при формировании просветов в полостных органах (например, в сердце). Апоптоз наблюдается при атрофии зрелых тканей под влиянием или при отмене эндокринных стимулов при росте и старении организма. В качестве примеров могут быть приведены возрастная атрофия тимуса, возрастная инволюция ткани эндометрия и предстательной железы, молочных желез после прекращения лактации. Классическим примером может служить апоптоз В- и Т-лимфоцитов после прекращения действия на них стимулирующего действия соответствующих цитокинов при завершении иммунных реакций.

Установлена патология апоптоза в виде его относительного снижения по сравнению с пролиферацией опухолевых клеток, а также его "незавершенность"-отсутствия фагоцитоза погибших опухолевых клеток и их частей. Это приводит к образованию и накоплению постапоптозного детрита в опухолях, который может подвергаться в дальнейшем аутолизу (постапоптозному некрозу). Незавершенность апоптоза при опухолевом росте может таить в себе опасность стимулирования роста опухоли, поскольку постапоптозный детрит, аккумулирующий в себе множество факторов роста, клеточных онкогенов и цитокинов, может служить мощным триггером деления клеток.

А.И. Воложин₁, Ю.И. Денисов-Никольский₂, А.А. Докторов₂
ПРИМЕНЕНИЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ КОСТНОЙ ТКАНИ НА ОСТЕОПЛАСТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛАХ
₁Кафедра патологической физиологии стоматологического факультета МГМСУ,
₂Научно-исследовательский и учебно-методический Центр биомедицинских технологий "Вилар"

В комплексном лечении многообразных заболеваний костей скелета и замещении костных дефектов ведущее место принадлежит хирургическим методам. С этой целью используются различные технологии, в том числе, биорезорбируемые и биостабильные материалы природного и синтетического происхождения. К ним относятся, например, полимеры, наполненные синтетическим гидроксиапатитом: полиметилметакрилат, полиамид, сверхвысокомолекулярный полиэтилен и др. Они успешно заменяют остеопластические материалы биологического происхождения, которые обладают высокой иммуногенностью, несут опасность переноса трансмиссивных заболеваний; имеются также проблемы этического характера при заборе материала от трупов. Существенным недостатком искусственных остеопластических материалов является отсутствие у них остеоиндуктивных свойств, в связи с чем они долго интегрируются в костную ткань и не могут участвовать в функции скелета.

Перспективным является формирование костной ткани из клеток предшественников на синтетических заменителях костной ткани нового поколения, обладающих необходимыми для практической медицины свойствами. Однако технология заселения остеопластического материала остеогенными клетками до недавнего времени не была разработана. Для ее реализации было необходимо решение целого круга задач, включающих оценку токсичности материала по отношению к клеткам, адгезивных и многих других свойств. В связи с этим была сформулирована цель исследования: разработать в лабораторных условиях технологию использования разных биостабильных синтетических заменителей костной ткани как носителей мезенхимальных стволовых клеток костного мозга-источника костных клеток.

Коллективом МГМСУ, совместно с другими ведущими научными учреждениями, разработаны методы культивирования диплоидных постнатальных фибробластов и клеток стромы костного мозга человека, а также способы оценки количества клеток в слое, формирующемся на поверхности композитов и определения цитотоксичности образцов композитов, эффективности прикрепления клеток к их поверхности (скрининговый МТТ-тест, прижизненное окрашивание флуоресцеинацетатом, бромистым этидием и акридиновым оранжевым фиксированных клеток). Изучено влияние образцов на эффективность клеточной пролиферации в процессе культивирования по количеству клеток, их морфологии и характеру распределения по поверхности образцов. Выявлена эффективность пролиферации мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в процессе их культивирования на поверхности остеопластических материалов. Показано, что исследуемые полимерные материалы не токсичны и способны создавать условия для пролиферации мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костных клеток.

Полученные результаты открывают перспективу дальнейших фундаментальных исследований и научно-практических разработок. Их целью может быть использование биостабильных композитов для формирования на их поверхности слоя костных клеток, полученных из мезенхимальных клеток костного мозга человека. Эти композиты будут использованы для изготовления имплантатов нового поколения, которые, обладая высокими механическими свойствами, способны быстро интегрироваться с костью при возмещении дефектов костей скелета.

О.В. Зайратьянц
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Кафедра патологической анатомии МГМСУ.

Перспективы исследования стволовых клеток (СК) и их использования в регенераторной медицине и тканевой инженерии сопряжены с проблемой их идентификации. Не существует специфических морфологических маркеров (фенотипических, ультраструктурных и др.), позволяющих достоверно выявлять эмбриональные и соматические СК, прослеживать их пролиферацию и дифференцировку в культуре или после трансплантации.

Уже по своему определению (недифференцированные клетки) СК не имеют тканевоспецифических маркеров и представлены клетками эмбриона и тканей плода (I группа) и СК взрослого организма-постнатальными или соматическими (II группа).

К I группе относят эмбриональную СК, которую получают из 5-дневной бластоцисты после удаления (иммунохирургическим и другими методами) клеток трофоэктодермы. Она отличается способностью к бесконечной пролиферации симметричным делением и дифференцировки в любые клетки. Другие, сходные с ней клетки этой группы представлены клетками эмбриональной карциномы и эмбриональной герминальной клеткой, которую получают из гонад абортов 5-9 недель развития.

Фенотипические особенности эмбриональных СК-минимальный набор белков и универсальность большинства изученных маркеров. Характерна экспрессия:

- стадий-специфических эмбриональных антигенов 3 и 4 (SSEA-3, SSEA-4), функциональное значение которых неизвестно;?
- фактора транскрипции, уникального для эмбриональных СК (Oct-4);
- специфических молекул экстрацеллюлярнго матрикса (GCTM-2), гликопротеинов с высокой молекулярной массой (TRA-1-60, TRA-1-81) ??
- теломеразы (ее выраженная экспрессия в эмбриональных СК-индикатор "бессмертия" клетки).?
- Кроме того, типична высокая активность щелочной фосфатазы, что, однако не является специфическим признаком.

Таким образом, в настоящее время для иммуноморфологической визуализации эмбриональных СК в тканях (например, в начальные фазы после их трансплантации) или при изучении и выделении их в культурах может быть использован лишь ограниченный набор маркеров, которые нередко экпрессируются и другими клетками. В связи с этим, для контроля за выделением и культурами эмбриональных СК используются, в основном, биологические пробы.

Ко II группе относят соматические СК дифференцированных тканей, которые обнаружены во всех типах тканей. Они отличаются ограниченным пролиферативным потенциалом с асимметричным делением. Открыта возможность их трансдифференцировки, хотя и с некоторыми ограничениями (пластичность). В зависимости от особенностей микроокружения и других воздействий, кроветворная или мезенхимальная СК способны в клетки крови, эндотелий, остеоциты, хондроциты, адипоциты, теноциты, гепатоциты, миоциты сердца, нейроны и др. Изучается пластичность эпидермальной, нейрональной, мышечной и сердечной СК. Наибольшим пролиферативным потенциалом и низкой иммуногенностью (что важно при аллотрансплантации) обладают кроветворные СК, полученные из пуповинной крови.

Фенотипически первичная соматическая (кроветворная) СК характеризуется следующими маркерами (или отсутствием определенных маркеров):

- СD34-основной маркер кроветворных СК,трансмембранный сиаломуцин, выявлен также на эндотелиоцитах, части фибробластов, клеток нервной ткани, его не экспрессируют клетки лимфом и других опухолей. Возможно, ответственен за клеточную адгезию, ингибирует гемопоэтическую дифференцировку. При дифференцировке СК быстро утрачивается. Имеется у 1-4% клеток костного мозга, 0,1% клеток периферической крови (после введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора их концентрация возрастает до 1%, что используется при выделении кроветворных СК у донора);??
- CD59-экспрессируется на многих клетках (защита от комплемент-зависимого цитолиза); ??
- CD90 (Thy1 )- имеется также на нейронах, фибробластах, субпопуляции Т-лимфоцитов. Возможно, принимает участие в ингибировании пролиферации и дифференцировки СК, в процессах памяти в нервной ткани;
- CD7-характерен также для большинства пре-Т- и Т-лимфоцитов (их активация);
- CD40-имеется также на В-клетках, макрофагах, дендритных и эпителиальных клетках, фибробластах. Его роль многообразна: пролиферация клеток, продукция ими цитокинов, переключение синтеза изотипов иммуноглобулинов В-клетками;??
- CD45-"общий" лейкоцитарный антиген, имеется на всех гемопоэтических клетках, лимфоцитах (до 10% их поверхности). Для разных популяций клеток характерны его различные изоформы. Участвует в активации Т- и В-лимфоцитов; ??
- CD123-рецептор цитокинов, имеется на гранулоцитах, моноцитах, эритроидных клетках и мегакариобластах. Поддерживает рост и дифференцировку гемопоэтических клеток.??
- CD133-малоизученный маркер СК и гемопоэтических клеток; ??
- CD135-имеется также на миеломоноцитарных и ранних В-клеточных предшественниках. Обнаружен при острых лимфо- и миелобластных лейкозах. Рецептор факторов роста;??
- CD184-рецептор из суперсемейства рецепторов к G-протеинам, выявлен также на некоторых гемопоэтических клетках;??
- CD243-рецептор из суперсемейства АТФ-связывающих транспортных белков, свойственный СК. Один из белков множественной лекарственной устойчивости;??
- отсутствие экспрессии CD38-АДФ-рибозилциклазы, маркера ранних или активированных Т- и В-лимфоцитов, плазмоцитов и NK-клеток;??
- отсутствие экспрессии CD117 (C-kit)-маркера гемопоэтических стволовых клеток (но, возможно и кроветворных СК), тканевых лаброцитов, меланоцитов, клеток тканей репродуктивной системы. Регулирует пролиферацию и дифференцировку клеток;??
- отсутствие экспрессии около 13-14 различных маркеров (lin) дифференцированных кроветворных клеток.

Недавно было показано, что покоящиеся кроветворные и мезенхимальные СК, напротив, CD34 не экспрессируют, а морфологически ближе к фибробластоподобным, а не моно- и лимфоцитоподобным клеткам.

Как видно, указанные маркеры экспрессируют не только первичные кроветворные СК, но и частично дифференцированные соматические СК, а также не стволовые клетки. Для выделения кроветворных СК (из пуповинной или периферической крови, из костного мозга) используют различные физические и биологические методы (иммуномагнитная сепарация, проточная цитофлюорометрия, селективная клеточная агглютинация, селективное химическое разрушение и др.). Одна кроветворная СК приходится на 100 тыс. клеток периферической крови человека и на 10-15 тыс.-костного мозга. Однако для их точной идентификации (например, для разграничения первичных СК-долгоживущих, способных к самоподдержанию, составляющих 5-20% от числа выделяемых современными методами, от короткоживущих клеток предшественников, не способных к самоподдержанию) при работе с клеточными культурами используют биологические пробы.

Идентификация и исследование клеток (аутологичных и аллогенных), после их культивирования, дифференцировки и использования в тканевой инженерии (ретрансплантации или трансплантации в виде отдельных клеток, в биополимерных и иных каркасах, в виде "живых эквивалентов тканей" и т.д.) - задача не менее сложная, чем морфологическое исследование СК. Они фенотипически неотличимы от сходных клеток рецепиента. Для выяснения судьбы трансплантированных клеток (от СК до дифференцированных клеток) предложено использовать "метод Y-хромосомы", радиоактивные (ауторадиография) и иные метки. Так, например, трансдифференцировка кроветворных СК в гепатоциты была доказана с помощью метода с Y-хромосомой. За исключением хромосомного метода (дорогостоящего и нередко невыполнимого), все прочие признаны пока недостаточно достоверными. В частности, при гибели трансплантированной клетки метка попадает в местные клетки системы мононуклеарных фагоцитов и в окружающие клетки. Показано, что аллогенные клетки выполняют роль временной биологически активной "повязки"-подвергаются уничтожению, но инициируют пролиферативную активность собственных клеток рецепиента и локальный ангиогенез.

Перспективным является одновременное использование нескольких маркеров и специальных меток с последующим ауторадиографическим или иммуноморфологическим исследованием (на световом и ультраструктурном уровнях), важно дальнейшее развитие молекулярно-биологических методов в морфологии.

Все права защищены!
Изменения, дополнения, копирование, повторная печать и любые иные действия в отношении изложенного материала без согласия авторов будут безоговорочно преследоваться по закону.
ЦМБТ и логотип CMBT являются зарегистрированной торговой маркой ® 2004-2005